农作物秸秆提供了大量可持续和可转化为生物燃料和生物产品的木质纤维素残留物。由于纤维素乙醇被评为汽油添加剂，净碳排放量较低，各种先进技术已经尝试改善生物质的酶糖化和生物乙醇转化。天然木质纤维素的顽固性决定了物理和化学生物质预处理效果强，酶消化率低，导致木质纤维素加工价格过高，不适用于生物乙醇生产，并可能产生二次废弃物。因此，仍需探索高活性木质纤维素降解酶和温和条件下的生物质预处理。

由于其优越的分泌能力，里氏木霉已被广泛应用于生产商业木质纤维素降解酶的主要工业真菌菌株。里氏木霉菌株需要分泌不同类型的酶来完全消化木质纤维素。例如，内切-β-1，4-葡聚糖酶通过断裂纤维素微纤维的无定形链来释放低聚糖，而纤维生物水解酶断裂纤维素链以产生纤维二糖。因此，最终需要β-葡萄糖苷酶来消化纤维二糖以生产可发酵的葡萄糖。同时，里氏木霉还分泌各种木聚糖酶用于半纤维素水解。然而，由于所有类型的酶都由几种异构体组成，生物量降解酶的最佳组合在很大程度上是不同的，这取决于木质纤维素的特性。一种细菌膨胀素(BsEXLE)蛋白具有与预处理过的木质纤维素残基高度结合的活性，但其在里氏木霉体内分泌木质纤维素降解酶和体外生物质酶糖化中的级联应用尚不清楚。

本研究首先从枯草芽孢杆菌中克隆了EXLX1基因，进行了表达及分泌系统的优化，筛选出工程菌株TrEXLX10，其分泌的滤纸酶、胞外葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性较对照(空载体)有较大幅度的提高。同时，本工作测定了TrEXLX10菌株的蛋白质水平显著提高，并进一步利用TrEXLX10分泌的粗酶检测玉米和芒草秸秆经温和碱处理后的生物量糖化程度。更重要的是，本研究在体外从TrEXLX10菌株中纯化了EXLX蛋白，并表征了其与三种主要壁聚合物的独特相互作用，这为理解膨胀素激活在里氏木霉分泌木质纤维素降解酶和生物能源作物生物量酶促糖化中的作用提出了一个新的假设模型。

用于高活性酶生产的理想工程T.Reesei菌株（TrEXLX10）的选择

在这项研究中，BsEXLX1基因最初被克隆到用Ppdc启动子驱动的里氏木霉菌株（Rut-C30）中过表达。本研究通过对10个转基因里氏木霉品系TrEXLX1-10的筛选，收集其分泌的粗酶，并测定其体外滤纸活性。作为比较，TrEXLX10菌株被选为以下实验的理想工程菌株，因为其检测到的PFA最高(图1)。本研究分别测定了工程TrEXLX10和Rut-C30菌株体外分泌的五种酶活性(图A-E)。除了类似的CMC酶活性外，TrEXLX10菌株中其他四种酶的活性均显著高于Rut-C30菌株，且p＜0.01（n＝3）。特别是，TrEXLX10菌株的木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性分别提高了159%和82%，而其滤纸和pNPC活性分别增加了32%和34%。同时，TrEXLX10菌株的总蛋白水平也比Rut-C30菌株高40%（图1F）。由于BsEXLX已被表征为能够与木质纤维素底物结合的活性膨胀素，因此研究结果表明，TrEXLX10菌株最初可能分泌足够的膨胀素来激活芒属木质纤维素底物，以促进里氏木霉消化纤维素和半纤维素作为碳源，从而导致所检测的TrEXLX10菌株有效分泌纤维素酶和木聚糖酶。

TrEXLX10分泌酶对生物质糖化作用的持续独立增强

由于TrEXLX10菌株可以分泌上述多种高活性的生物质降解酶，本工作通过提供商业混合纤维素酶，TrEXLX10或Rut-C30菌株分泌的全部粗酶，对玉米和芒草秸秆进行两步酶解(图2)。玉米(0.05% NaOH)和芒草(1% NaOH)秸秆进行弱碱预处理后，首先使用商业混合纤维素酶消化预处理后的木质纤维素残渣48小时，剩余的颗粒进一步与TrEXLX10或Rut-C30菌株分泌的粗酶孵育。同时，将分泌的粗酶与商业混合纤维素酶进行了平行实验。结果，在两个平行实验中，玉米和芒草样品中TrEXLX10分泌的酶释放的己糖产量均显著高于Rut-C30(p<0.01水平(n=3))(图2A,B)。尽管TrEXLX10菌株可以分泌比Rut-C30更高活性的木聚糖酶，但两株菌株在玉米和芒草样品中释放的戊糖产量相似(图2C,D),表明在这个反应体系中，商业混合纤维素酶或分泌的粗酶都可以充分地进行半纤维素水解。此外，酵母发酵是通过利用酶解释放的糖来完成的，在p<0.01的水平上，TrEXLX10分泌的酶水解物产生的玉米和芒草样品的生物乙醇产量显著高于RUT-C30的生物乙醇产量(图2E)，与它们独特的酶糖化作用一致。根据理论上的戊糖-乙醇转化率，在TrEXLX10分泌的酶的水解物中总生物乙醇产量也显著提高(图2F)。

为了证实TrEXLX10分泌的酶水解提高了己糖产量，本研究进一步测试了四种玉米和芒草秸秆的生物质糖化，通过使用商业混合纤维素酶或TrEXLX10或Rut-C30菌株分泌的粗酶进行一步水解。TrEXLX10分泌的纤维素酶水解物的己糖得率显著高于RUT-C30或混合纤维素酶，己糖得率提高55%，在这三个水解反应中也确定了相似的戊糖产量。

用玉米(1%NaOH)和芒属(4%NaOH)秸秆进行了高浓度的碱处理，与RUT-C30分泌的纤维素酶相比，TrEXLX10分泌的酶的两步酶水解法显著提高了己糖的产量(表2)。值得注意的是，即使将分泌的酶与商品混合纤维素酶以1：1的比例混合进行一步水解，TrEXLX10样品获得的己糖得率(89%纤维素)仍高于RUT-C30样品(69%纤维素)(表2)，这为TrEXLX10分泌的酶独立促进生物质酶糖化提供了一致的证据。此外，由于商业混合纤维素酶对所有主要的木质纤维素降解酶都具有高活性的特征，因此获得的所有数据表明，持续增强的糖化作用不仅是由于TrEXLX10菌株分泌的高活性酶，也可能是由于TrEXLX10分泌的膨胀素在酶水解过程中对木质纤维素顽固性的特异性改善发挥了非催化作用。此外，由于玉米和芒属秸秆具有不同的木质纤维成分，生物质糖化的不同协同促进作用可能是由于不同的膨胀素与其木质纤维底物相互作用所致。

TrEXLX10分泌稳定的纤维素酶复合体用于高生物量酶糖化

为了了解TrEXLX10分泌的酶对生物质糖化的持续增强作用，本研究使用TrEXLX10或Rut-C30菌株分泌的粗酶对玉米秸秆进行了时间过程酶解(图3)。作为对比，TrEXLX10分泌的酶解不断释放出比Rut-C30样品更高的己糖产量，在48h酶解后，己糖产量大多提高到26%(图3A)。TrEXLX10分泌酶水解物上清液的Zeta电位值相对较低(图3C)。通过SDS-PAGE对可溶性蛋白进行分离，TrEXLX10样品的CBH、BGL和XYN三种酶对应的条带明显强于Rut-C30样品(图3D)，说明TrEXLX10较高的蛋白水平主要来源于分泌较多的生物量降解酶。因此，它提供了直接的证据来解释为什么不同类型的酶活性在TrEXLX10分泌的溶液中显著提高，以获得更高生物量的酶糖化。

本研究还进行了不添加玉米秸秆条件下的时程酶解对照实验(图3E)。相比之下，TrEXLX10菌株在48h的酶解过程中上清液中的蛋白质水平略有下降，而RUT-C30样品的总蛋白水平在24小时后急剧下降，这表明TrEXLX10菌株分泌的酶应该比RUT-C30菌株的更稳定。TrEXLX10菌株分泌的膨胀素可能在稳定上清液中的纤维素酶方面发挥了其他作用，这应该是TrEXLX10分泌的酶解物持续提高生物质消化率的另一个原因。

TrEXLX10分泌的膨胀素对纤维素水解的协同增强作用

由于工程培养的TrEXLX10菌株能够分泌活性膨胀素，对生物质酶糖化过程进行非催化增强，本研究利用His-tag特异性从粗酶液中纯化膨胀蛋白，与EXLX蛋白连接(图4A)。进一步将纯化的膨胀素加入到商业混合纤维素酶中，在体外实验中，与不添加膨胀素的对照实验相比，FPA显著提高(p<0.01) (n=3)(图4C)，这为TrEXLX10菌株也可以分泌活性膨胀素以协同增强作物秸秆生物质酶糖化的假设提供了证据。

TrEXLX10分泌的膨胀素与木质纤维素底物的独特相互作用

由于TrEXLX10分泌的膨胀素对提高生物量酶解率具有协同作用，进一步纯化了膨胀素，并与三种标准底物进行体外培养(Avicel，木聚糖和木质素)，他们是主要作物秸秆中木质纤维素残基的三种主要壁聚合物。测定了TrEXLX10分泌的膨胀素与木质素底物具有最高的结合活性，而Avicel和木聚糖底物具有相似的结合活性(图5A)。然而，BsEXLX1与木质素的结合活性仅比Avicel和木聚糖底物高出<40%。同时，与以前鉴定的与木质素结合活性为主、与壁多糖相互作用较小的蛋白质相比，TrEXLX10分泌的膨胀素与纤维素和半纤维素底物保持了相对较高的结合活性，证实了其在改善不同木质纤维素底物的顽固性方面的独特作用。这也可以解释为什么TrEXLX10菌株可以分泌不同类型的纤维素酶和木聚糖(表3)，主要是因为它与所有主要的壁聚合物具有高度的结合活性。